2017年十大科學(xué)突破中，“精準(zhǔn)定位的基因編輯”榜上有名，研究人員修改了基因編輯工具，做到“精確到點(diǎn)”的修改，這使得基因“剪刀”在未來可能撬動(dòng)更大的市場(chǎng)。

軟軟的、十幾納米大小，核酸酶的“微觀照”更像一大團(tuán)“棉花糖”。百科上這樣介紹它：它的發(fā)現(xiàn)和采用，使基因的“編輯”，包括插入、刪失、融合等操作成為可能。它內(nèi)部是“分區(qū)”的，有的區(qū)管“定位”、有的區(qū)管“切割”……

正是這把“棉花糖”樣的“剪刀”就要“利刃出鞘”——美國(guó)某著名咨詢公司近日發(fā)布報(bào)告稱，全球基因組編輯(包括CRISPR、TALEN和ZFN)的市場(chǎng)規(guī)模將從2017年的31.9億美元增長(zhǎng)到2022年的62.8億美元，復(fù)合年均增長(zhǎng)率為14.5%。

產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)的“全面開花”還只是一部分，“點(diǎn)”的突破仍在基因編輯行業(yè)不斷產(chǎn)生。美國(guó)《科學(xué)》雜志近日公布的2017年十大科學(xué)突破中，“精準(zhǔn)定位的基因編輯”榜上有名，研究人員修改了基因編輯工具，做到“精確到點(diǎn)”的修改，這使得基因“剪刀”在未來可能撬動(dòng)更大的市場(chǎng)。

三種手段，各有千秋

“蘑菇有個(gè)釋放孢子的‘習(xí)慣’，之后摘下來的蘑菇就要變黑，拿到市場(chǎng)上也不好賣。”清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心研究員謝震深入淺出，怎么讓它不黑，通過敲除誘發(fā)這個(gè)“習(xí)慣”的基因，“生物活動(dòng)被阻斷了，就不會(huì)變黑了，進(jìn)而延長(zhǎng)貨架期。”

對(duì)自然界一些“拙作”進(jìn)行“美化”，是人們希望通過基因編輯做到的。

現(xiàn)有的3種基因編輯技術(shù)ZFN、TALEN、CRISPR，又是怎么做到編輯基因，改變生物活動(dòng)的呢?“ZFN、TALEN技術(shù)可以視為一類，它們是通過外源的蛋白質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞后找到DNA序列的。”謝震說，“CRISPR技術(shù)的‘核心功能組件’則不同，有一部分是RNA序列，另一部分是蛋白質(zhì)。”

要完成編輯工作，它們的架構(gòu)和功能都很相似，3種技術(shù)中依賴的“核心組件”，都必須擁有“定位”功能和“剪切”功能：ZFN技術(shù)中的蛋白叫鋅指核酸酶，由于三維結(jié)構(gòu)像人的手指，中間有鋅離子而得名;TALEN技術(shù)中的蛋白叫轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶。

兩個(gè)核酸酶都有分區(qū)，即可特異性識(shí)別序列的DNA結(jié)合域和進(jìn)行非特異性切割的DNA切割域。

在CRISPR技術(shù)中，識(shí)別特異性DNA序列的工作由“向?qū)NA”配合完成，而不是由蛋白質(zhì)單獨(dú)完成，切割DNA的工作仍由蛋白質(zhì)完成。

“酶的不同，使得技術(shù)的復(fù)雜程度和應(yīng)用范圍也不相同，”謝震說，例如“一拖多”的基因編輯工作，即能夠一次同時(shí)編輯多個(gè)基因的任務(wù)，CRISPR最容易做到，TALEN困難一些，ZFN卻很困難。

構(gòu)造3種編輯工具的工作非常繁瑣，盡管CRISPR相對(duì)簡(jiǎn)單，但是很多研究團(tuán)隊(duì)還是希望這種工具“拿來就用”。

為此，專門有研究團(tuán)隊(duì)將酶的部件轉(zhuǎn)變成“模塊”，按需“組裝”就能獲得識(shí)別特定DNA序列的編輯工具。例如，通過研究者長(zhǎng)期的努力，識(shí)別每一種三聯(lián)堿基的64種鋅指組合中已有大部分被發(fā)現(xiàn)并編撰成目錄，這些相關(guān)數(shù)據(jù)也都能夠在公共的數(shù)據(jù)庫或者文獻(xiàn)中被檢索到。

也就是說，針對(duì)要編輯的不同基因，這3種方法都必須進(jìn)行“定制”才能“服務(wù)”，而隨著基因編輯技術(shù)的研究不斷深入，公共技術(shù)平臺(tái)將積累起越來越多的共性研究，“定制化”將變得越來越簡(jiǎn)單。應(yīng)用門檻的降低，勢(shì)必會(huì)帶來市場(chǎng)規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大。

輕松導(dǎo)航，占據(jù)市場(chǎng)最大份額

盡管“定制服務(wù)”簡(jiǎn)易化是趨勢(shì)，但是定制CRISPR的簡(jiǎn)便是與生俱來的，因?yàn)樗蒖NA做“向?qū)?rdquo;，與DNA的“親近”程度比蛋白質(zhì)更近一步。

一篇《基因編輯，別忘了還有ZFN和TALEN》的文章去年7月發(fā)表在生物技術(shù)專業(yè)網(wǎng)站生物通上，一個(gè)“還”字，讓CRISPR這種基因編輯技術(shù)的火爆不言自明。CRISPR設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，讓其出現(xiàn)最晚，卻應(yīng)用最廣。

“向?qū)NA的合成非常容易，只要確定序列，按照序列互補(bǔ)性原則合成就可以。”謝震說，“但是蛋白質(zhì)與DNA的作用，不存在‘互補(bǔ)’這樣明確的關(guān)系，要合成用于向?qū)У牡鞍踪|(zhì)區(qū)域，需要一整套流程，包括預(yù)測(cè)、驗(yàn)證等。”

謝震解釋，這方面TALEN相對(duì)容易一些，根據(jù)已有的TALEN蛋白結(jié)合DNA的特性，可以幫助設(shè)計(jì)出與特定DNA序列結(jié)合的蛋白，ZFN是“定制服務(wù)”中最復(fù)雜的。

正因?yàn)镃RISPR靈活的“轉(zhuǎn)場(chǎng)”能力，它在各個(gè)領(lǐng)域的基因編輯中獲得了廣泛應(yīng)用。分析報(bào)告中指出，CRISPR有望占據(jù)全球市場(chǎng)的最大份額。

這也致使ZFN技術(shù)的擁有者Sangamo生物技術(shù)公司老總“酸葡萄”般地表示，CRISPR盡管效率高，但在“精確度”上不及ZFN，不能用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。2017年，該公司組織實(shí)施了第一例人體基因改造治療的臨床試驗(yàn)，向血液內(nèi)注入基因編輯工具ZFN，以期治療亨特氏綜合征。

事實(shí)上，CRISPR技術(shù)也已開始在醫(yī)學(xué)診斷和治療方面開展臨床試驗(yàn)。2016年，我國(guó)四川大學(xué)華西醫(yī)院就用CRISPR技術(shù)刪除了肺癌患者免疫細(xì)胞中的PD-1蛋白基因，再將基因編輯后的免疫細(xì)胞重新注入患者血液中，期望治療癌癥。

“可以通過對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)的微調(diào)，提高核酸酶的識(shí)別能力。”謝震表示，很多提高CRISPR精確度的研究工作正在進(jìn)行，2016年，謝震團(tuán)隊(duì)就在《自然》子刊上發(fā)表論文稱，他們通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合理拆分Cas9蛋白，利用多輸入合成基因線路感知不同分子信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了在不同類型細(xì)胞中對(duì)Cas9/dCas9活性的精確調(diào)控，為精確控制CRISPR/Cas9基因編輯工具提供了新的策略。

技術(shù)進(jìn)步，精確度再刷新

“之前是剪刀將雙鏈剪斷后，仰仗細(xì)胞的自我修復(fù)能力以及修補(bǔ)的DNA模板修補(bǔ)基因。現(xiàn)在不剪斷，直接讓堿基變身。”《科學(xué)》雜志2017十大突破中的堿基編輯器，是哈佛大學(xué)團(tuán)隊(duì)對(duì)CRISPR技術(shù)的改進(jìn)，通過核心組件——“酶”的變化實(shí)現(xiàn)了編輯功能上的進(jìn)步。謝震解釋稱：“原來的Cas9酶的活性喪失了，結(jié)合上沒有‘剪刀’能力，但與其他蛋白融合能變成使單個(gè)堿基突變的酶。”

“最開始他們?cè)谧匀唤缯业搅诉@種能定向突變C-T堿基的酶，后來他們自己造了另一種能夠定向突變A-G堿基的酶。”謝震說，“目前要解決的是準(zhǔn)確性問題，如果在特定區(qū)域存在多個(gè)重復(fù)的堿基，要突變哪一個(gè)是需要確定的事。例如把目標(biāo)位點(diǎn)5個(gè)堿基以內(nèi)的A全部突變掉，需要精確到單個(gè)堿基。”

據(jù)報(bào)道，基因組編輯技術(shù)主要應(yīng)用在細(xì)胞系改造、遺傳工程、診斷和治療等方面。目前細(xì)胞系改造占最大份額，基因編輯干細(xì)胞療法的研究認(rèn)知度高。“基因編輯更像一種底層技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)功能或者產(chǎn)品的渠道和方法，期待它的產(chǎn)品能夠早日落地。”謝震說。

相關(guān)鏈接

三大基因編輯技術(shù)

基因編輯是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確定位到基因組的某一位點(diǎn)上，在該位點(diǎn)剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。目前主要三大基因編輯技術(shù)：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶技術(shù)(ZFN);轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(TALEN);RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas核酸酶技術(shù)。

ZFN技術(shù)分兩步完成，對(duì)DNA進(jìn)行特異性切割，形成DNA雙鏈斷裂區(qū);通過破壞非同源末端鏈接使目的基因失活，或借助同源重組等方式完成DNA的修復(fù)連接，可以使斷裂的DNA雙鏈重新黏合。

TALEN技術(shù)的原理并不復(fù)雜，即通過 DNA識(shí)別模塊將TALEN元件靶向特異性的DNA位點(diǎn)并結(jié)合，在同一個(gè)蛋白上有序地實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核、靶位點(diǎn)DNA的特異性識(shí)別和靶位點(diǎn)DNA的切割這三個(gè)不同的功能。

CRISPR-Cas技術(shù)使用一段序列特異性向?qū)NA分子(crRNA)引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶到靶點(diǎn)處，從而完成基因組的編輯，其編輯基因一般分兩步進(jìn)行——crRNA的合成及在crRNA引導(dǎo)下的RNA結(jié)合與剪切。